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His交融卵白纯化罕见题目解答

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  卵白过镍柱纯化的原理:Ni-NTA纯化介质纯化带有His6-Tag的交融卵白是现在卵白纯化中最常利用的一种办法。Ni柱中的氯化镍大概硫酸镍可以与有HIs(组卵白)标签的碱性卵白卵白联合,组卵白标签一样平常是6个组氨酸(碱性氨基酸)。在卵白上样后,带有组氨酸标签的卵白特异性联合到柱子里,其他的杂卵白流出。Ni柱中的氯化镍大概硫酸镍也可以与咪唑联合,接纳咪唑洗脱,咪唑竞争性联合到硫酸镍上,目标卵白就被洗脱了,这时分搜集穿出液,内里便是目标卵白,然后透析失咪唑即可。上样,洗濯,洗脱,根本三个步调就完毕了。

  

 

  1. His 标签卵白没有与柱联合:

  

 

  a)大概缘故原由:超声的功率不合错误(太大,卵白炭化,太小,卵白没有开释)

  办理办法:改动超声功率,并在超声前参加溶菌酶

  b)大概缘故原由:样品大概是联合缓冲液不准确:

  办理办法:检测pH 及样品和联合缓冲液的构成份。确保在溶液中鳌合剂或强复原剂的浓度及咪唑的浓度不是太高。

  c)大概缘故原由:组氨酸标签表露不完全

  办理办法:在变性条件下( 用4-8 M 脲,或4-6 M 盐酸胍) 举行纯化。

  d)大概缘故原由:His标签丧失

  办理办法1:WB 反省His 能否表达,下游构建,改动His-tag 的地位(C-端或N-端),须要时增长His个数。

  办理办法2:孵育的工夫不敷,低落流速和增长孵育的工夫。

  办理办法3:改动螯合的金属离子,寻觅到最佳的联合金属离子。

  Ni2+通常是从宿主细胞卵白中纯化大少数6×His标志的重组卵白质的首选金属离子。也是一样平常最常用的离子。卵白和金属离子之间的联合强度受几种要素影响,包罗长度、地位、亲和标志在卵白的表露水平、所用离子的范例、以及缓冲液的pH,因而一些卵白用其他离子大概更容易地举行纯化而不必Ni2+。

  2. His 标签卵白没有被洗脱上去:

  a)大概缘故原由:洗脱条件太平和(组氨酸标志的卵白质仍旧联合在柱上,联合力较强)

  办理办法:增长咪唑的梯度洗脱或低落pH 来找出最佳的洗脱条件。

  b)大概缘故原由:低落pH 的办法洗脱的,若pH 低于3.5,会招致镍离子零落

  办理办法:改动洗脱措施,咪唑竞争性洗脱

  c)大概缘故原由:卵白已沉淀在柱上

  办理办法:增加上样量,或利用咪唑的线性梯度而不是分步洗脱以低落卵白的浓度。试用去污剂或改动NaCl 的浓度,或在变性条件( 去折叠)下洗脱( 用4-8 M 脲,或4-6 M 盐酸胍)。

  d)大概缘故原由:非特异性疏水或其他互相反响

  办理办法:加非离子去污剂到洗脱缓冲液(如:2% Triton X-100)或增长NaCl的浓度。

  3. His 标签卵白洗脱后杂带较多

  

 

  a)大概缘故原由:卵白酶局部降解了标签卵白

  办理办法:添加卵白酶克制剂。

  b)大概缘故原由:杂质对镍离子有更高的亲和性

  办理办法1:咪唑浓度必需优化,以确保高纯度( 宿主细胞卵白质的低联合) 和高产率( 组氨酸标志的目的卵白质的强联合) 之间的最佳均衡。分步大概线性洗脱探索出最优的咪唑联合和洗濯浓度;在样品中参加与联合缓冲液异样浓度的咪唑;咪唑的梯度不大(20 个或更多的柱床体积),大概分散出有类似联合强度的卵白

  办理办法2:挑选最合适的缓冲液条件,NaCl 浓度,pH的范畴都必要举行挑选。关于单一目的卵白在举行缓冲液挑选时,将缓冲液、盐、甘油和复原剂设计成差别的混淆配方来举行优化。

  办理办法3:若以上优化的条件都不克不及去除杂质卵白,必要思索多步纯化的思绪,如使用Strep 标签举行两步纯化或接纳Subtractive method 举行纯化。

  c)大概缘故原由:杂质和标签卵白联合在一同

  办理办法:在超声破裂细胞之前参加去垢剂大概复原剂;增长去垢剂的浓度( 2% Triton X-100 or 2% Tween 20);大概在Wash buffer 中增长甘油的浓度(50%) 增加非特异性的互相反响;思索增长咪唑的浓度大概改动金属离子。

  d)大概缘故原由:洗濯不充实

  办理办法:增长洗濯的次数,使洗濯充实。

  4. 利用频频后Ni柱载量降落,挂柱服从低,怎样处置?

  大概缘故原由:渐渐积聚沉淀,变性或非特异联合的卵白占有了无效的联合位点,而经过洗脱液无法彻底洗濯所致。

  较平和的洗濯办法:

  用2倍柱体积的6M盐酸胍或8M尿素洗濯,然后用5倍体积的缓冲液洗濯,以去除沉淀或变性物质。用2倍柱体积的1% Triton X-100洗濯,然后用5倍柱体积的缓冲液洗濯,以去除疏水联合的物质。若改动不分明,可选择激烈洗濯方法。

  激烈洗濯方法:

  起首用5-10倍柱体积的脱镍缓冲液(20 mM 磷酸钠, 0.5 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7.4)洗濯,迚行脱镍操纵,然后用5-10倍柱体积的均衡缓冲液冲洗,最初用5-10倍柱体积的双蒸水冲洗;随落伍行洗濯操纵,去除离子型杂卵白,可以用5倍柱体积的1.5 M NaCl溶液,然后10倍柱体积的双蒸水冲洗;去除沉淀或变性卵白,可以用1M氢氧化钠溶液,联合1-2小时,然后用10倍柱体积的均衡缓冲液和10倍柱体积的双蒸水迚行冲洗;去除疏水卵白大概脂卵白,可以用5-10倍柱体积的30%异丙醇溶液洗濯,然后10倍柱体积的双蒸水洗濯;最初举行生镍操纵,用0.1M硫酸镍上柱,随后5倍柱体积的双蒸水宁静衡缓冲液迚行洗濯,如需保管,保管在20%乙醇溶液。

  5. 镍柱利用中呈现棕色是怎样回事?

  大概缘故原由:缓冲液中DTT的影响, DTT会对镍柱的颜色和纯化服从有很大的影响,在碱性的缓冲液条件下,镍离子会被DTT复原天生棕色的沉淀,以是要只管即便制止DTT的到场。

  因而,若您的样品中含有DTT,在上样之前, ag真人保举接纳不含复原性试剂的空缺运转来撤除任何较弱联合的镍离子;空缺运转办法(利用不含复原剂的均衡液和洗脱液)1)5倍柱体积的双蒸水洗柱;2)5倍柱体积的均衡液洗柱;3)5倍柱体积的洗脱液洗柱;4)10倍柱体积的均衡液均衡。当不利用时,勿将Ni Sepharose 6 Fast Flow保管于含复原性试剂的缓冲液中。

  6. 填料能否可以反复利用?可以利用几多次?

  假如维护的好的话,填料在其效期之内可以不停反复利用。假如每次都是纯化异样的卵白就没有须要剥离失镍离子重新挂镍,一样平常颠末5-7次纯化之后可以举行脱镍和再生镍的操纵。假如柱子反压高了,填料必要做彻底的在位洗濯CIP,在洗濯之前,为了制止金属盐的沉淀,必要剥离失镍离子,然后再重新挂镍,洗濯后保管在20%的乙醇中。